PRACTICA:DETERMINACION DE IDENTIDAD GENETICA 15/5/15

PRIMERA PARTE

MATERIAL:
Gradilla
Micropipeta
Vaso de precipitado
Centrifuga
Papel para film
Pipeta de vidrio de 5 ml
Prepipeta
Tubos de ensayo
Ependoff
Rotulador de vidrio
Palillo
Bata
Guantes
Papel de fieltro
REACTIVOS:

• Suero salino
• Matriz infangene(Purificador de ácidos nucleicos ,extrae ADN)

MUESTRA:
Mucosa bucal
FUNDAMENTO:
Repiticion de secuencias de pequeños fragmentos de ADN. A cada persona se le repite un numero determinado .No es único,pero si característico de cada individuo ,y este es conocido como huella genetica


DESARROLLO:
1.Añadimos en un vaso de precipitado suero salino
2.Colocamos un tubo de ensayo en la gradilla , y depositamos con una pipeta de vidrio de 5 ml  , 3 ml de suero en el tubo
3.Nos enjuagamos la boca con agua y rascamos ambos lados internos de la misma con un palillo
4.Introducimos el palillo en el tubo de ensayo y lo mezclamos unos 2 minutos aproximados
5.Extraemos de ahí 1.4 ul y lo introducimos en un eppendof
6.Lo centrifugamos a 8000 rpm durante 5 minutos
7.Retiramos el sobrenadante
8.Añadimos en el eppendor 70 ul de matriz instangene , e incubamos en una maquina de baño seco durante 10  minutos a  100 grados centigrados
9.Dejamos enfriar y centrifugamos a 13.000 rpm durante 30 minutos
10.Por ultimo extraemos 10 ul del tubo de eppendof  y lo depositamos en otro tubo nuevo
11.Lo congelamos

SEGUNDA PARTE

MATERIAL:

Vaso de precipitado

Bata

Guantes

Micropipeta de 2 ul , 18.5 ul y 2.5 ul

Puntas de micropipeta

Centrifuga

Termociclador

Tubo de ready to go

Gradilla de corcho

Rotulador de vidrio

REACTIVOS:

• Oligo 1   2 ul
• oligo 2  2 ul
• Agua destilada 18.5 ul

MUESTRA:

2.5 ul de eppendor preparada en la primera parte

DESARROLLO:

1.Preparamos el agua destilada en un vaso de precipitado

2.Cogemos una gradilla de corcho y colocamos el eppendof de nuestro ADN y el tubo ready to go

3.Extraemos 2.5 ul de nuestro ADN y lo depositamos en un ready to go y añadimos al mismo 2 ul de aligo 1 y 2 ul de oligo 2 y finalmente 18.5 ul de agua destilada

4.Mezclamos suavemente

5.Centrifugamos un golpe

6.Colocamos el tubo ready to go en el termociclador , cerramos la tapa y ya comienza los 30 ciclos

7.Lo retiramos y se guarda en frigorífico

TERCERA PARTE

MATERIAL:

Balanza

Pipeta de 10 ml

Vaso de precipitado

Rotulador de vidrio

Microondas

Matraz

Probeta de 100 ml

Micropipeta de 1.5 ul

Puntas desechables

Bata

Guantes

Vidrio de reloj

REACTICOS:

• Agua destilada
• Tampon TAE 10 ml
• AGarosa 1.5 gr
• Red safe nucleic acid staining solution

DESARROLLO:

1.Pesamos 1.5 g de agarosa en la balanza y la depositamos en una probeta de 100 ml

2.Añadimos 10 ml de tampón en la probeta de 100 ml y  depositamos la disolución de agarosa

3.A continuación ,enrasamos hasta 100 ml de agua destilada

4.Lo depositamos la mezcla en un matraz Erlenmeyer

5.Calentamos en microondas unos segundos

6.Lo sacamos y lo movemos un poco  y lo volvemos a calentar , hasta ver que esta totalmente diluida la mezcla

7.Dejamos enfriar unos minutos

8.Añadimos 1.5 ul de red safe nucleic acid staining solution y  ya tenemos lista la agarosa para realizar la electoforesis que seria el ultimo proceso

CUARTO PROCESO

MATERIAL:

Balanza

Vidrio de reloj

Prepipeta

Pipeta de vidrio de 2 ml

Probeta de 10 ml

Cubeta especial

Cinta adhesiva

Fuente de alimentación

Eppendof

Micropipeta de 10 ul y 5 ul

Puntas desechables

Bata

Guantes

Papel de fieltro

REACTIVOS:

• Ladder
• Agarosa
• Tampon de carga(glicero 30% , azul de metileno y agua destilada)
• Tampon TAE

MUESTRA:

Primer eppendof:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga

Segundo eppendof: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

DESAROLLO:

1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa

2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente

3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .

4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo

5.Añadimos el tampón TAE

6.Añadimos control en las esquinas

7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.

8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos

9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta

PRACTICA:PRUEBA CRUZADA MAYOR

MATERIAL:
Tubo de hemolisis
Papel de fieltro
Gradilla
Bata
Guantes
Centrifuga
Baño María
Pipeta pasteur
Cronometro
REACTIVOS:

• Solución salina fisiológica
• Suero antiglobulina de coombs
• Albumina bovina al 30 %

MUESTRA:
Hematies tipados al 5%
Suero del receptor
FUNDAMENTO:
Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante , primero en medio salino ,posteriormente en medio albuminoso y por ultimo frente al suero antiglobulina de coombs.Con este ultimo paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria
DESARROLLO:
1.Depositamos 1 gota de supension de hematíes al 5% y 2 gotas del suero receptor
2.Mezclamos suavemente , lo dejamos reposar de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente
3.Centrifugamos a 3500 rpm durante 30 segundos (1700 a 1 minuto ) porque la centrifuga no tiene segundos
4.Leemos el resultado en medio salino
En el caso de no presenta aglutinación se sigue haciendo pruebas:
5.Añadimos 3 gotas de albumina bovina al 30 %
6.Meclamos suavemente e incubamos en el baño maria a 37 grados durante 30 minutos
7.Centrifugamos a 3500 rpm durante 30 segundos (1700 durante 1 minuto)
8.Leemos los resultados en medio albuminoso
En el caso de dar la prueba negativa se sigue haciendo otro proceso:
9.Lavamos los hematíes con solución salina 3 veces
10.Añadimos 1 gota de suero coombs y centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos
11.Leemos los resultados
RESULTADOS
LECTURA DE LOS RESULTADOS:
Consiste en resuspender el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones
INTERPRETACION CLINICA DE LOS RESULTADOS:

• La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles , la transfusión es posible
• La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad
• Si se observa hemolisis en cualquiera de los pasos , también es signo de incompatibilidad

HOJA DE TRABAJO:
1.¿Que se enfrenta en la prueba cruzada mayor?
Consiste en enfrentar suero del receptor con los hematíes del donante
2.¿Cuando se debe realizar la prueba cruzada mayor?
Cuando se transfunde una gran cantidad de plasma
3.¿Por que debemos realizar la prueba en medio albuminoso y salino?
Para detectar todos los anticuerpos presentes
4.¿Que pone de manifiesto el suero antiglobulina de coombs?
Detectamos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria
RESULTADOS OBTENIDOS:

	RESULTADOS
MEDIO SALINO	-
MEDIO ALBUMINOSO	-
SUERO ANTIGLOBULINA	-

 

VALORACION DE LOS RESULTADOS:
Existe una ausencia de aglutinación , por lo tanto las sangres son compatibles y se puede realizar la transfusión.
Sangre A2 con plasma B son incompatibles
Sangre B con  plasma A1 y A2 son incompatibles
OBSERVACIONES:
Como la centrifuga no puede poner segundos , hemos tenido que calcular el tiempo que pondríamos para que los resultados no salgan defectuosos  , lo cual seria 1700 rpm durante 1 minuto