PRACTICA DE ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA 29/1/2015

ELECTROFORESIS

MATERIAL:

Gradilla

Tubo de centrifuga

Centrifuga

Estufa

Fuente de alimentacion

Medio soporte

2 pipeta pasteur

Pipeta graduda de 0.5 ,1 ,2 y 5 ml

Espectrofotometro

Pinzas

Reloj

Puente

Fotodensimetro

Cubeta de espectrofotometro

Vidrio de reloj

Papel de fieltro

Probetas de 100 ml

Placa de vidrio 

Cubeta

Aplicador

REACTIVOS:

• Suero fisiológico
• Agua destilada
• Tampon(tris-hidroximetilaminometano,glicocola, y agua destilada)
• Colorante(Rojo ponceau y acido tricloroacetico)
• Decolorante
• Deshidratante(metanol)
• Solucion transparentadora(A: metanol y ciclohexanoma) y (B:acido acético)

MUESTRA:

1.Anticoagular la sangre problema

2.Centrifugar a 3000rpr durante 5 minutos

3.Retirar el plasma

4.Los hematies lo resuspendemos de 4-5 ml de suero fisiologico

5.Centrifugamos los hematies a 3000 rpr durante 5 minutos

6.Retiramos el sobrenadante

7.Repetir el lavado de los hematies 3 veces mas

8.Hemolizar los hematies , añadiendo 1 volumen de estos, 1.5 de agua destilada y 0.5 de cloroformo

9.Mezclamos la muestra

10.Centrifugar la mezcla a 3000rpm durante 20 minutos

11.Retirar el hemolizado

12.Determinar la concentracion de Hb que esta presente en el hemolizado

13.Diluir el hemolizado con agua destilada hasta llegar a 5g/dl

FUNDAMENTO:

Para separar el diferente tipo de hemoglobina en función de su carga eléctrica o punto de isoelectrico

DESARROLLO:

1.Sumergir las tiras en tampon durante 10 minutos

2.Absorver el exceso de tampon de las tiras , situandolas en entre dos hojas de papel de fieltro

3.Montar las tiras sobre el puente

4.Verter en la cubeta de tampon suficiente para que los electrodos queden cubiertos

5.Introducir el puente con las tiras,en el interior de la cubeta

6.Depositar la dilucion del hemolizado en el interior de un vidrio de reloj y tocarla

7.Situar la dilucion del hemolizado , mediante el aplicador previamente cargado , sobre el extremo catodico y a 1.5 cm de su borde libre

8.Conectar la cubeta de alimentacion

9.Encender la fuente de alimentacion y aplicar una corriente de 200 voltios durante 90 minutos

10.Apagar el alimentador y desconectarlo de la cubeta

11.Sumergir las tiras, con su carga absorvente hacia abajo , en el colorante elegigo ,durante 10 minutos

12.Decolorar las tiras , hasta que se vea el fondo blanco

RESULTADO:

LECTURA DE LOS RESULTADOS

1.Deshidratar las tiras, sumergiendolas en metanol durante 1 minuto

2.Sumergir las tiras en una mezcla de soluciones transparentadoras preparadas recientemente , se efectua bajo agitacion y durante 1  o 2 minutos

3.Extender las tiras sobre una placa de vidrio

4.Calentar la placa en una estufa , a una temperatura de 60-70 grados hasta la transparencia de las tiras

5.Dejar enfriar la placa

6.Desprender las tiras de la placa

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

La electroforesis permite detectar anomalias hemoglobinicas cuantitativas o cualitativas.

• Cuantitativas:Se deben al aumento o la disminución de un tipo normal de Hb
• Cualitativas:Pequeños cambios de aminoácidos que componen las cadenas de globina de alguna molécula de Hb

HOJA DE TRABAJO:

1.¿De que material son las tiras empleadas en esta practica?
Tipo de Hb
2.¿Cual es el decolorante del rojo ponceau?
Es igual que el negro amido
3.¿Como se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable?
Fotodensimetro
4.¿En que enfermedad aparece una banda electroforetica de Hb S?
En la anemia falciforme
5.¿Cual es la Hb normal mas electronegativa?
Beta -Talasemia

RESULTADOS OBTENIDOS: